El presente proyecto de Norma Oficial Mexicana se publica a efecto de que los interesados dentro de los siguientes 90 días naturales, contados a partir de la fecha de su publicación, presenten sus comentarios ante el Comité Consultivo Nacional de Normalización de Regulación y Fomento Sanitario, sito en Lieja No. 7, 1er. piso, colonia Juárez, código postal 06696, México, D.F.

Durante el plazo mencionado, los análisis que sirvieron de base para la elaboración del proyecto de Norma estarán a disposición del público para su consulta en el domicilio del Comité.

México, Distrito Federal, a 26 de mayo de 1994.

PREFACIO

En la elaboración de la presente Norma participaron los siguientes Organismos e Instituciones:

SECRETARIA DE SALUD

Dirección General de Control Sanitario de Bienes y Servicios

Laboratorio Nacional de Salud Pública

SECRETARIA DE PESCA

Instituto Nacional de la Pesca

SECRETARIA DE AGRICULTURA Y RECURSOS HIDRAULICOS

Comisión Nacional del Agua

INSTITUTO POLITECNICO NACIONAL

Escuela Nacional de Ciencias Biológicas

INDUSTRIAS VINICOLAS PEDRO DOMECQ, S.A. DE C.V.

JUGOS DEL VALLE, S.A. DE C.V.

LECHE INDUSTRIALIZADA CONASUPO, S.A. DE C.V., LICONSA

SIGMA ALIMENTOS, S.A. DE C.V.

LABORATORIO ICCABI, S.A. DE C.V.

LABORATORIO FERMI, S.A.

SOCIEDAD MEXICANA DE NORMALIZACION Y CERTIFICACION, S.C., NORMEX

INDICE

  0 INTRODUCCION

  1 OBJETIVO Y CAMPO DE APLICACION

  2 FUNDAMENTO

  3 REFERENCIAS

  4 DEFINICIONES

  5 SIMBOLOS Y ABREVIATURAS

  6 REACTIVOS Y MATERIALES

  7 APARATOS E INSTRUMENTOS

  8 PREPARACION DE LA MUESTRA

  9 PROCEDIMIENTO

10 EXPRESION DE RESULTADOS

11 INFORME DE LA PRUEBA

12 OBSERVANCIA DE LA NORMA

13 CONCORDANCIA CON NORMAS INTERNACIONALES

14 BIBLIOGRAFIA

0 INTRODUCCION

El grupo de los microorganismos colifornes es el más ampliamente utilizado en la microbiología de los alimentos como indicador de prácticas higiénicas inadecuadas.

El uso de los coliformes como indicador sanitario puede ser aplicado a:

Prácticas sanitarias deficientes tanto en el manejo como en la fabricación de los alimentos.

La calidad microbiológica de un producto, lo que no necesariamente implica un riesgo sanitario.

Evaluación de la eficiencia de prácticas sanitarias e higiénicas del equipo.

Calidad del agua y hielo utilizados en las diferentes áreas del procesamiento de alimentos.

La demostración y la cuenta de microorganismos coliformes puede realizarse mediante el empleo de cultivos líquidos o sólidos con características selectivas o diferenciales.

1 OBJETIVO Y CAMPO DE APLICACION

1.1 Esta Norma Oficial establece el método microbiológico para determinar el número de microorganismos coliformes totales presentes en productos alimenticios por medio de la técnica de cuenta en placa.

1.2 Esta Norma Oficial Mexicana es de observancia obligatoria en el territorio nacional para las personas físicas o morales que requieran efectuar este método en productos nacionales y de importación.

2 FUNDAMENTO

Por esta técnica se efectúa la cuenta de microorganismos coliformes, utilizando el método de vaciado en placa con agar rojo violeta bilis , el cual es un medio selectivo en donde las bacterias se desarrollan a 35° C durante 24 a 48 horas, fermentando la lactosa, dando como resultado la producción de gas y ácidos, los cuales viran el indicador de pH presente en el medio y precipitan las sales biliares.

3 REFERENCIAS

Esta Norma se complementa con lo siguiente:

NOM-008-SCFI-1993       Norma Oficial Mexicana. Sistema General de Unidades de Medida.

                                   Secretaría de Comercio y Fomento Industrial.

NOM-109-SSA1-1994      Procedimiento para la Toma, Manejo y Transporte de Muestras de Alimentos

                                   para su Análisis Microbiológico.^*

NOM-110-SSA1-1994      Preparación y Dilución de Muestras de Alimentos para su Análisis

                                   Microbiológico.^*

NOM-092-SSA1-1994      Método para la Cuenta de Bacterias Aerobias en Placa.^*

NOM-112-SSA1-1994      Determinación de Bacterias Coliformes. Técnica del Número más

                                   Probable.^*

4 DEFINICIONES

Para fines de esta Norma se entiende por:

Coliformes, bacterias que a 35°C fermentan la lactosa con formación de ácido, ocasionando en las colonias desarrolladas el vire del indicador rojo neutro presente en el medio y la precipitación de las sales biliares.

5 SIMBOLOS Y ABREVIATURAS

Cuando en esta Norma se haga referencia a las siguientes abreviaturas y símbolos se entiende por:

* Proyecto de Norma Oficial Mexicana en proceso de publicación.

g                                                                                                       gramo

ml                                                                                                     mililitro

l                                                                                                         litro

mm                                                                                                  milímetro

°C                                                                                                     grado Celsius

%                                                                                                      por ciento

pH                                                                                                    potencial de hidrógeno

N                                                                                                       normal

NMP                                                                                                 número más probable

RVBA                                                                                               agar-rojo-violeta-bilis-lactosa

1/d                                                                                                    inversa de la dilución

6 REACTIVOS Y MATERIALES

6.1 Reactivos.

Los reactivos que a continuación se mencionan deben ser grado analítico y cuando se indique agua debe entenderse como agua destilada.

6.1.1 Soluciones diluyentes.

6.1.1.1 Solución reguladora de fosfatos (solución concentrada).

                                                                    Fórmula

Fosfato monopotásico                                                            34 g

Agua                                                                                              1,0 l

Preparación:

Disolver el fosfato en 500 ml de agua y ajustar el pH a 7,2 con solución de hidróxido de sodio 1,0 N.

Aforar con agua a un litro.

Esterilizar durante 15 minutos a 121°C. Conservar en refrigeración (solución concentrada).

Tomar 1,25 ml de la solución concentrada y llevar a un litro con agua (solución de trabajo).

Distribuir en porciones de 99, 90 y 9 ml según se requiera.

Esterilizar a 121°C durante 15 minutos.

Después de la esterilización, el pH y los volúmenes finales de la solución de trabajo deberán ser iguales a los iniciales.

6.1.1.2 Agua peptonada.

                                                                    Fórmula

Peptona                                                                                        1,0 g

NaCl                                                                                              8,5 g

Agua                                                                                              1,0 l

Preparación:

Disolver los componentes en un litro de agua.

Ajustar el pH a 7,0 con hidróxido de sodio 1,0 N.

Distribuir en porciones de 99, 90 y 9 ml o en cualquier volumen múltiplo de nueve, según se requiera.

Esterilizar a 121°C durante 15 minutos.

Después de la esterilización, los volúmenes finales de la solución de trabajo deberán ser iguales a los iniciales.

Si este diluyente no es usado inmediatamente, almacenar en lugar obscuro a una temperatura entre 0 a 5°C por un tiempo no mayor de un mes, en condiciones tales que no alteren su volumen o composición.

6.1.2 Medio de cultivo.

Agar-rojo- violeta-bilis-lactosa (RVBA)

                                                                       Fórmula

Peptona                                                                                        7,0 g

Extracto de levadura                                                                   3,0 g

Lactosa                                                                                      10,0 g

Sales biliares                                                                              1,5 g

Cloruro de sodio                                                                         5,0 g

Rojo neutro                                                                                 0,03 g

Cristal violeta                                                                               0,02 g

Agar                                                                                             15,0 g

Agua                                                                                              1,0 l

Preparación:

Mezclar los componentes en el agua y dejar reposar durante algunos minutos.

Mezclar perfectamente y ajustar el pH a 7,4 con ácido clorhídrico 0,1N o con hidróxido de sodio 0,1N a 25°C, de forma que después del calentamiento se mantenga en este valor.

Calentar con agitación constante y hervir durante 2 minutos.

Inmediatamente enfriar el medio en un baño de agua hasta que llegue a 45°C.

Evitar el sobrecalentamiento del medio.

No debe esterilizarse en autoclave.

Usar el medio dentro de las tres primeras horas después de su preparación.

En el caso de utilizar medio de cultivo deshidratado, seguir las instrucciones del fabricante.

6.2 Materiales.

Pipetas bacteriológicas para distribuir 10 y 1 ml (o si es necesario de 11 y 2 ml), con tapón de algodón. Las pipetas pueden ser graduadas en volúmenes iguales a una décima de su volumen total.

Frascos de vidrio de 250 ml con tapón de rosca.

Tubos de 16 X 150 mm con tapón de rosca.

Utensilios esterilizables para la obtención de muestras: cuchillos, pinzas, tijeras, cucharas, espátulas, etc.

Cajas Petri.

Todo el material e instrumentos que tengan contacto con las muestras bajo estudio deberán esterilizarse mediante:

Horno, durante 2 horas a 170 - 175°C.

Autoclave, durante 15 minutos como mínimo a 121 ± 1°C.

El material de vidrio puede sustituirse por material desechable que cumpla con las especificaciones deseadas. No debe usarse material de vidrio dañado por las esterilizaciones repetidas y éste debe ser químicamente inerte.

7 APARATOS E INSTRUMENTOS

Horno para esterilizar que alcance una temperatura mínima de 170°C.

Autoclave con termómetro y manómetro, calibrada con termómetro de máximas y mínimas.

Baño de agua con circulación mecánica, provista con termómetro calibrado con divisiones de 0,1° C y que mantenga la temperatura a 45 ± 0,5°C.

Licuadora de una o dos velocidades controladas por un reóstato o bien un homogeneizador peristálico (Stomacher).

Vasos para licuadora con tapa esterilizables o bolsas estériles para Stomacher.

Incubadora con termostato que evite variaciones mayores de ± 1,0° C, provista con termómetro calibrado.

Contador de colonias de campo oscuro, con luz adecuada, placa de cristal cuadriculada y lente amplificador.

Registrador mecánico o electrónico.

Microscopio óptico.

Potenciómetro con una escala mínima de 0,1 unidades de pH a 25 °C.

8 PREPARACION DE LA MUESTRA

La preparación de la muestra será de acuerdo a lo establecido en la NOM-110-SSA1-1994 "Preparación y Dilución de Muestras de Alimentos para su Análisis Microbiológico".

9 PROCEDIMIENTO

9.1 Colocar por duplicado en cajas Petri 1 ml de la muestra líquida directa o de la dilución primaria, utilizando para tal propósito una pipeta estéril.

9.2 Repetir el procedimiento tantas veces como diluciones decimales se requiera sembrar, utilizando una pipeta estéril diferente para cada dilución.

9.3 Verter de 15 a 20 ml del medio RVBA fundido y mantenido a 45 ± 1 °C en baño de agua. El tiempo transcurrido entre la preparación de la dilución primaria y el momento en que es vertido el medio de cultivo, no debe exceder de 20 minutos.

9.4 Mezclar cuidadosamente el inóculo con el medio con seis movimientos de derecha a izquierda, seis en el sentido de las manecillas del reloj, seis en el sentido contrario y seis de atrás para adelante, sobre una superficie lisa. Permitir que la mezcla solidifique dejando las cajas Petri reposar sobre una superficie horizontal fría.

9.5 Preparar una caja control con 15 ml de medio para verificar la esterilidad.

9.6 Después de que está el medio completamente solidificado en la caja, verter aproximadamente 4 ml del medio RVBA a 45 ± 1°C en la superficie del medio inoculado. Dejar que solidifique.

9.7 Invertir las placas y colocarlas en la incubadora a 35°C, durante 24 ± 2 horas.

9.8 Después del periodo especificado para la incubación, contar las colonias con el contador de colonias.

9.9 Seleccionar las placas que contengan entre 15 y 150 colonias. Las colonias típicas son de color rojo oscuro, generalmente se encuentran rodeadas de un halo de precipitación debido a las sales biliares, el cual es de color rojo claro o rosa, la morfología colonial es semejante a lentes biconvexos con un diámetro de 0,5 a 2,0 mm.

10 EXPRESION DE RESULTADOS

10.1 Cálculo del método.

10.1.1 Placas que contienen entre 15 y 150 colonias características.

Separar las placas que contienen el número antes mencionado de colonias características en dos diluciones consecutivas. Contar las colonias presentes. Calcular el número de coliformes por mililitro o por gramo de producto, multiplicando el número de colonias por el inverso de la dilución correspondiente.

10.1.2 Placas que contienen menos de 15 colonias características.

Si cada una de las placas tiene menos de 15 colonias características, reportar el número obtenido seguido de la dilución correspondiente.

10.1.3 Placas con colonias no características.

Si en las placas no hay colonias características, reportar el resultado como: menos de un coliforme por 1/d por gramo, en donde d es el factor de dilución.

11 INFORME DE LA PRUEBA

Informar: cuenta de microorganismos coliformes en placa de agar rojo violeta bilis, incubados a 35°C durante 24 ± 2 hrs.

12 OBSERVANCIA DE LA NORMA

La vigilancia del cumplimiento de la presente Norma corresponde a la Secretaría de Salud.

13 CONCORDANCIA CON NORMAS INTERNACIONALES

Esta Norma no tiene concordancia con normas internacionales.

14 BIBLIOGRAFIA

14.1 Bacteriological Analitycal Manual. 1984. Food and Drugs Administration FDA. Bureau of Foods. Division of Microbiology. 6^a Ed. Washington, D.C.

14.2 Manuales para la Determinación de Organismos Coliformes Totales. Laboratorio Nacional de Salud Pública. Secretaría de Salud.

14.3 Norma ISO 4832-1991. Microbiology-General Guidance for the Enumeration of Coliforms- Colony Count Technique. International Organization for Standardization.

14.4 NORMA-Z-013/02. 1981. Guía para la Redacción, Estructuración y Presentación de las Normas Oficiales Mexicanas. Secretaría de Comercio y Fomento Industrial.