PROYECTO de Norma Oficial Mexicana NOM-119-SSA1-1994, Bienes y servicios. Materias primas para alimentos, productos de perfumería y belleza. Colorantes orgánicos naturales. Especificaciones sanitarias.
Al margen un sello con el Escudo Nacional, que dice: Estados Unidos Mexicanos.- Secretaría de Salud.- Comité Consultivo Nacional de Normalización de Regulación y Fomento Sanitario.
MERCEDES JUAN LOPEZ, Presidente del Comité Consultivo Nacional de Normalización de Regulación y Fomento Sanitario, con fundamento en el artículo 39 de la Ley Orgánica de la Administración Pública Federal, 3 fracción XXII, 13, 132, 194 fracción I, 197, 401 Bis, 401 Bis 1, 401 Bis 2 de la Ley General de Salud; 3 fracción XI, 38 fracción II, 40 fracción I, VI, VIII, XI, XIII; 41, 43, 44, 45, 47, 50, 53 de la Ley Federal sobre Metrología y Normalización y los aplicables del Reglamento de la Ley General de Salud en Materia de Control Sanitario de Actividades, Establecimientos, Productos y Servicios, y 13 fracción I del Reglamento Interior de la Secretaría de Salud, me permito ordenar la publicación en elDiario Oficial de la Federación del Proyecto de Norma Oficial Mexicana NOM-119-SSA1-1994, Bienes y Servicios. Materias Primas para Alimentos, productos de Perfumería y Belleza. Colorantes Orgánicos Naturales. Especificaciones Sanitarias.
El presente Proyecto de Norma Oficial Mexicana se publica a efecto de que los interesados dentro de los siguientes 90 días naturales, contados a partir de la fecha de su publicación, presenten sus comentarios ante el Comité Consultivo Nacional de Normalización de Regulación y Fomento Sanitario, sito en Lieja número 7, 1er. piso, colonia Juárez, código postal 06696, México, D.F.
Durante el plazo mencionado, los análisis que sirvieron de base para la elaboración del Proyecto de Norma estarán a disposición del público para su consulta en el domicilio del Comité.
México, D.F., a 26 de mayo de 1994.
PREFACIO
En la elaboración de esta Norma participaron los siguientes organismos e instituciones:
Secretaría de Salud
Laboratorio Nacional de Salud Pública
Dirección General de Control Sanitario de Bienes y Servicios
Secretaría de Comercio y Fomento Industrial
Dirección General de Políticas Comerciales
Procuraduría Federal del Consumidor
Instituto Politécnico Nacional
Escuela Nacional de Ciencias Biológicas
Universidad Nacional Autónoma de México
Facultad de Química
Universidad Autónoma Metropolitana
Asociación Nacional de Fabricantes de Productos Aromáticos
Cámara Nacional de la Industria de la Transformación
Cámara Nacional de la Industria de Perfumería y Cosmética
Coca Cola de México, S.A de C.V.
Confederación de Cámaras Industriales
Industrias Cuamex, S.A. de C.V.
Laboratorios Mixim, S.A.
Mane de México, S.A de C.V.
Probamex, S.A. de C.V.
Productos Roche, S.A de C.V.
Spectrum, S.A de C.V.
INDICE
0 INTRODUCCION
1 OBJETIVO Y CAMPO DE APLICACION
2 REFERENCIAS
3 DEFINICIONES
4 SIMBOLOS Y ABREVIATURAS
5 CLASIFICACION
6 ESPECIFICACIONES
7 MUESTREO
8 METODOS DE PRUEBA
9 ETIQUETADO
10 ENVASE Y EMPAQUE
11 CONTROL
12 OBSERVANCIA DE LA NORMA
13 CONCORDANCIA CON NORMAS INTERNACIONALES
14 BIBLIOGRAFIA
15 APENDICES NORMATIVOS
APENDICE A
0 INTRODUCCION
Las disposiciones de la presente Norma Oficial Mexicana son de orden público e interés social y establece las especificaciones de identidad y pureza de los colorantes orgánico-naturales; para su aplicación en los alimentos y productos de perfumería y belleza, en los que se emplean como materias primas. Al considerarse éstos como aditivos, su uso puede representar un riesgo para la salud al encontrarse en ellos niveles altos de contaminantes, sustancias o solventes que se empleen para la extracción y que resultan perjudiciales para la salud del consumidor.
Dichas especificaciones sólo se satisfacen cuando en su elaboración se utilicen materias primas de calidad sanitaria, se apliquen buenas prácticas de manufactura, se realicen en locales e instalaciones bajo condiciones higiénicas, que aseguren que son aptos para consumo humano, de acuerdo con lo establecido por la Ley General de Salud, su Reglamento y demás disposiciones aplicables de la Secretaría de Salud.
1 OBJETIVO Y CAMPO DE APLICACION
1.1 Esta Norma Oficial Mexicana establece las especificaciones sanitarias de los colorantes orgánicos naturales.
1.2 Esta Norma Oficial Mexicana es de observancia obligatoria en el territorio nacional para las personas físicas o morales que se dedican a su proceso e importación.
2 REFERENCIAS
Esta Norma se complementa con lo siguiente:
NOM-038- SSA1-1993 Materias primas para alimentos, productos de perfumería y belleza.
* Proyecto de Norma Oficial Mexicana en proceso de publicación.
3 DEFINICIONES
Para los fines de esta Norma se entiende por:
3.1 Colorante, material que imparte color a otro material o mezcla, elaborado por un proceso de síntesis o similar, por extracción o por separación, obtenido de una fuente animal, vegetal o mineral y que posteriormente se ha sometido a pruebas fehacientes de seguridad que lo liberan para su uso en alimentos y en productos de perfumería y belleza o en alguna parte de ellos, y que directamente o a través de su reacción con otras sustancias es capaz de impartir el color que le caracteriza.
3.2 Colorante orgánico natural, pigmento o sustancia que se obtiene a partir de materia vegetal o animal, con un limitado proceso químico o sin él y sometidos posteriormente a pruebas de identidad y pureza que les permita ser utilizados en alimentos, productos de perfumería y belleza, en alguna parte de éstos o en todo y que directamente o a través de su reacción con otras sustancias, es capaz de impartir el color que le caracteriza.
4 SIMBOLOS Y ABREVIATURAS
Cuando en esta Norma se haga referencia a los siguientes símbolos y abreviaturas, se entiende por:
kgkilogramo
mgmiligramo
llitro
mlmililitro
µlmicrolitro
µgmicrogramo
ppmpartes por millón
cm centímetro
KOHhidróxido de potasio
kpaconstante de disociación
mmmilímetro
°Cgrados Celsius
nmnanómetro
CIColor index
%porciento
Ecoeficiente de extinción
* signo de multiplicación
Nnormal
Cuando en la presente Norma se mencione el Reglamento, debe entenderse que se trata del Reglamento de la Ley General de Salud en Materia de Control Sanitario de Actividades, Establecimientos, Productos y Servicios.
5 CLASIFICACION
5.1 Para efectos de esta Norma los colorantes orgánicos-naturales permitidos son:
5.1.1 En alimentos
Aceite de zanahoria (Daucuscarota.L);
Achiote, annato (extracto de semillas de Bixaorellana);
Azafrán (estigmas de CrocussativusL.);
Beta-Apo-8'-Carotenal;
Betabel Deshidratado;
Beta caroteno;
Cantaxantina;
Color caramelo;
Clorofila;
Cochinilla (extracto de Coccuscacti,L. o carmín);
Cúrcuma (polvo y oleoresina del rizoma de CurcumalongaL.);
Extracto de color de uva (uva concord) (Antocianina);
Extracto de tegumento de uva (Enocianina);
Harina de semilla de algodón, cocida, tostada y parcialmente desgrasada;
Jugos de frutas;
Jugos de vegetales;
Pimentón en polvo (Capsicumannum,L.) Paprika;
Oleoresina de pimentón;
Riboflavina;
Riboflavina-5-fosfato;
Ester apocarotenoico, y
Xantófilas.
5.1.2 En productos de perfumería y belleza
Achiote, annato (extracto de semillas de Bixaorellana);
Beta caroteno;
Cochinilla (extracto de Coccuscacti,L., o carmín);
Color caramelo;
Guaiazuleno;
Guanina, y
Henna.
6 ESPECIFICACIONES
6.1 Físicas y químicas
Los colorantes orgánicos naturales deben cumplir con las siguientes especificaciones físicas, químicas, de identidad y pureza:
6.1.1 ACEITE DE ZANAHORIA
Sinónimos: Daucus carota L
6.1.1.1 Pureza:
Hexano; no más de 25 ppm
Total de ácidos grasos; no menos de 85%
Valor de Iodo; de 118 a 134
Valor de saponificación; de 165 a 185
Materia insaponificable; no más de 14%
Alcohol isopropílico; no más de 100 ppm.
6.1.2 ACHIOTE, ANNATO
6.1.2.1 Físicas
CI Natural Orange 4; Lebensmittel. Nr. 3 Rocou; Bixina; Norbixina; Orleans;
Terre orellana.
Clase:Carotenoide
Número de Código:CI (1956) 75120
CI (1954) 1241
Schultz (1931) 1387
Nombre Químico:La principal materia colorante de los extractos de bija o achiote en aceite es el carotenoide bixina. Es el éster dibásico simétrico. La materia colorante principal de los extractos acuosos de bija es la sal alcalina de la norbixina.
Peso Molecular:
Bixina: 394,52
Norbixina: 380,48
Color:Amarillo (Naranja en solución)
Solubilidad: La bixina es insoluble en agua, ligeramente soluble en etanol y fácilmente
soluble en éter y en los aceites.
Punto de Fusión:Bixina: 198°C
6.1.2.2 Pureza
Arsénico (como As); no más de 3 ppm
Plomo (como Pb); no más de 10 ppm
6.1.2.3 Identificación
6.1.2.3.1 Espectrofotometría de absorción, en cloroformo:
Máx. a 503, 474,5 y 439 nm
E1%1cm 2870 a 502 nm
Norbixina: Máx. a 509, 471,5 y 442 nm
E1%1cm 2870 a 482 nm (en NaOH 0,1N)
La bixina y la crocetina son los dos únicos carotenoides que no se oxidan fácilmente por el oxígeno del aire.
6.1.2.3.2 Cromatografía en columna:
Bija: La bixina es adsorbida enérgicamente en la superficie de la alúmina formando una zona rojo-naranja brillante (a diferencia de la crocetina). Con metanol o etanol producen un cambio de color; de naranja a amarillo-naranja. Con la reacción de Carr-Price, la zona de la bixina se vuelve inmediatamente verde-azulado (diferencia de la crocetina).
Bixina:Tratamiento de bixina cristalizada con cloroformo y reacción de Carr-Price. Se obtiene color verde-azulado.
Soluciones alcalinas de norbixina
La norbixina forma una zona roja-naranja en la superficie de la columna.
6.1.3 Azafrán
Sinónimos: CI Natural yellow 6. Safran crocine, crocetina y croccus sativus.
6.1.3.1 Físicas
Número de código: CI 75100
Colorantes principales: crocina y crocetina
Peso molecular:
Crocina: 1 006,97
Crocetina: 328,41
Solubilidad:
Crocina: soluble en agua, ligeramente soluble en alcohol absoluto, glicerina y propilen glicol e insoluble en aceites vegetales.
Crocetina:Muy poco soluble en agua y solventes orgánicos, soluble en piridina y bases orgánicas similares.
Punto de fusión:
Crocina: 186°C (con descomposición)
Crocetina: 285°C (con descomposición)
6.1.3.2 Pureza:
Cenizas; no más de 8%
Colores extraños; negativo
Máxima absorción entre 464 nm y 434 nm
6.1.4 -ß Apo-8'-Carotenal
6.1.4.1 Físicas:
CI Orange 6
Número de Código:CI 40820
Estado físico:sólido
Peso molecular:416,65
Apariencia: polvo fino granular de color café pardo
Punto de fusión: 136°C - 140°C (con descomposición)
Solubilidad -Insoluble en agua, ligeramente soluble en etanol y en aceites vegetales (hasta aproximadamente 1,5%)
6.1.4.2 Pureza:
Pérdida de peso por secado; no más de 0,2%
Residuo a la ignición; no más de 0,2%
Plomo (como Pb); no más de 10 ppm
Arsénico (como As); no más de 1 ppm
6.1.4.3 Identidad:
Espectrofotometría; no menos de 96 ni más de 101% de C30H40O
Absorción máxima en ciclohexano; 456 a 485 nm
6.1.5 Betanina
6.1.5.1Físicas:
Sinónimos: Rouge de betteraves
Clase: Betanina.
Nombre Químico: Betanina 1-[2-(2,6 dicarboxi-1,2,3,4-tetra-
hidroxi-4-piridilideno)- etilideno]-5- -D-
glucopiranosil- oxi -6- hidroxindolium -2-
carboxilato.
Peso molecular: 550,48
Descripción: Líquido, pasta o polvo color rojo o rojo pardo.
Color: Rojo
Solubilidad: Fácilmente soluble en agua, insoluble en alcohol absoluto.
6.1.5.2 Pureza:
Nitrato; no más de 2 g de anión nitrato/g de color rojo
Arsénico (como As); no más de 1 ppm
Plomo (como Pb); no más de 10 ppm
Mercurio (como Hg); no más de 1 ppm
Metales pesados; no más de 40 ppm
Material volátil; no más de 4%
Cenizas insolubles en ácidos; no más de 0,5%
Contenido de color rojo expresado como betanina; no menos de 0,4%
6.1.5.3 Identificación:
Espectrofotometría;
pH 5.4: máximo característico a 530 nm
pH 8.9: máximo impreciso a 535 nm
E1%1cmde la betanina pura a 535 nm en agua: 475-625
6.1.6 ß -Caroteno
6.1.6.1 Físicas
CI Natural Yellow 26; CI Natural Brown 5;
CI Food Orange 5; Natural -Carotene; Mixed
Carotenes
Clase:Caroteno
Números de Códigos: CI (1956) 75130
CI (1975) 75130
ß caroteno CI (1975) 40800
Schultz 1403
Peso molecular:536,89
Color:Amarillo a naranja rojizo
Descripción:Cristales rojos en estado puro
Solubilidad:Los carotenos son insolubles en agua, ligeramente solubles en etanol y solubles
hasta 1% en los aceites vegetales.
Punto de fusión:Wcaroteno = 187 °C
ß caroteno = 176°C - 182°C
G caroteno = 178°C
6.1.6.2 Pureza
Arsénico (como As); no más de 3 ppm
Plomo (como Pb); no más de 10 ppm
Pérdida de peso por secado no más de 0,2%
Residuos por ignición no más de 0,2%
Ensayo espectrofotométrico: de 96 a 101%
6.1.6.3 Identificación
Espectrofotometría
E1%1cm decaroteno (trans) en hexano, máximo a 455-457nm y 482-486 nm.
Tratamiento con permanganato de potasio al 1% en álcali;
se oxidan obteniendo sustancias incoloras.
Tratamiento con nitrito sódico y ácido sulfúrico N; destrucción de carotenos y desaparición de color.
Cromatografía: Sólo se obtiene una zona para elcaroteno puro.
6.1.7 Cantaxantina
6.1.7.1 Físicas
CI Food orange 8.caroteno - 4, 4'-diona.
Cantaxantin
4,4'-dioxo- caroteno
Números de códigos: CI (1975) 40850
Peso molecular: 564,86
Estado físico: sólido
Descripción: Polvo cristalino de color violeta oscuro
Solubilidad:Es soluble en cloroformo, muy poco soluble en acetona e insoluble
en agua, etanol y aceites vegetales.
Punto de fusión: 207-212°C
6.1.7.2 Pureza
Pérdida por secado; no más de 0,2%
Trans-cantaxantina y otros carotenoides totales; no más del 5%
Plomo;no más de 10 ppm
Arsénico; no más de 3 ppm
Mercurio; no más de 1 ppm
Cenizas sulfatadas;no más de 0,1%
Metales pesados; no más de 10 ppm
Residuo a la ignición; no más de 0,2%
Contenido;de 96-101% (expresado como cantaxantina)
6.1.7.3 Identificación
Ensayo espectrofotométrico:
Una solución de cantaxantina en ciclohexano tiene una absorbancia entre 468 nm y 472 nm
6.1.8 Color caramelo
6.1.8.1 Físicas:
Sinónimos: CI Natural brown 10
Estado físico; se presenta en forma líquida de color café oscuro o negro
y en forma sólida, con olor característico a azúcar quemada y sabor amargo.
Solubilidad;soluble en agua, ligeramente soluble en etanol, insoluble en éter, acetona y
cloroformo
6.1.8.2 Pureza
Plomo (como Pb); no más de 5 ppm
Arsénico (como As); no más de 3 ppm
Mercurio (como Hg);no más de 0,1 ppm
Nitrógeno amoniacal;no más de 0,5%
4-metil-imidazol; no más de 0,02%
Dióxido de azufre;no más de 0,1%
6.1.9 Clorofila
6.1.9.1 Físicas:
CI Natural Green 3; Lebensmittel-Grün Nr.1
Clase: Forbina (igual a dihidroporfina).
Números de Códigos: CI (1956) 75810
CI (1921) 1249a
Schultz (1931) 1403
Nombre Químico: Clorofila (a): Complejo magnésico de 1, 3,5, 8- tetrametil-4-
Solubilidad:La clorofila es soluble en etanol, éter, cloroformo y bencina, insoluble en
agua.
6.1.9.2 Pureza
Arsénico (como As); no más de 3 ppm
Plomo (como Pb); no más de 10 ppm
6.1.9.3 Identificación
Reacción en fase parda (tratamiento con hidróxido de potasio al 10% en metanol); se produce un color pardo, regresando rápidamente a su color original.
Reacción con etanol; se produce un color verde-azul con fluorescencia rojo intenso.
6.1.10 Cochinilla o carmín
6.1.10.1 Físicas
Sinónimos: CI Natural red 4: Lebensmittel- Rot. Nr. 2.
Cochenille; Acide carminique, Carmine.
Clase:Antraquinona.
Números de Códigos: CI (1956) 75470
CI (1924) 1239
Schultz (1931) N° 1381
Nombre Químico:Sales alcalinas y lacas aluminicas del
ácido carmínico (el principio colorante)
Peso Molecular:Acido carmínico: 492,40
Color:Rojo
Solubilidad:Sus sales alcalinas son solubles en
agua y disolventes etanólicos.
6.1.10.2 Pureza
Para el caso de la cochinilla
Arsénico (como As); no más de 1 ppm
Plomo (como Pb); no más de 10 ppm
pH; no menos de 5,0 y no más de 5,5 a 25°C
Proteína (N X 6,25); no más de 2,2%
Sólidos totales; no menos de 5,7 y no más de 6,3%
Alcohol metílico; no más de 150 ppm
Acido carmínico; no menos de 1,8%
Para el caso del Carmín.
Arsénico (como As); no más de 1 ppm
Plomo (como Pb); no más de 10 ppm
Materia volátil (a 135°C por 3 horas); no más de 20%
Cenizas; no más de 12%
Acido carmínico; no menos del 50%
6.1.11 Cúrcuma
6.1.11.1 Físicas
Cúrcuma (Polvo y oleoresina del rizoma de Curcumalonga,L.)
Sinónimos: CI Natural Yellow 3; Lebensmittel - Gelb No. 6
Cúrcuma; Curcumine
Safran des Indes; Indian saffron
Clase:Di-cinamoil metano.
Número de Códigos: CI (1956) 75300
CI (1924) 1238
Schultz (1931) 1374
Nombre Químico:Curcumina (el principal colorante); 1,7-
Nombre Químico: Derivados cetónicos o hidroxílicos de los
carotenos.
Peso Molecular: Luteína; 568,85
Estado físico: sólido
Color: Amarillo
Solubilidad: Las xantófilas son solubles en grasas y
disolventes grasos y casi insolubles en éter
de petróleo.
Punto de fusión: Flavoxantina:184°CLuteína: 190°C
Rubixantina:160°CViolaxantina: 207°C
Rodoxantina: 219°CZeaxantina: 215,5°C
6.1.19.2 Pureza
Arsénico (como As); no más de 3 ppm
Plomo (como Pb); no más de 10 ppm
Mercurio (como Hg); no más de 1 ppm
Pérdida por desecación; no más de 0,2%
Residuos por ignición; no más de 0,2%
Total de carotenoides, otros diferentes de trans-cantaxantina, no más de 5%
6.1.19.3 Identificación
Espectrofotometría no menos de 96 ni más de 101% (luteína)
6.1.20 Guaiazuleno
6.1.20.1 Físicas
Nombre químico: 1,4-dimetil-7-isopropil - azuleno
Punto de fusión: 30,5 - 31,5°C
6.1.20.2 Pureza
Plomo (como Pb); no más de 20 ppm
Arsénico (como As); no más de 3ppm
Mercurio (como Hg); no más de 1 ppm
Color total; no menos de 99%
6.1.21 Guanina
6.1.21.1 Físicas
Sinónimos: CI Natural White 1
Número de Código: CI 75170
Descripción:material cristalino
Peso molecular: Guanina 151,13
Hipoxantina 136,11
6.1.21.2 Pureza
Residuo a la ignición; no más de 2%
Plomo; no más de 20 ppm
Arsénico; no más de 3 ppm
Mercurio (como Hg); no más de 1 ppm
Contenido total de purinas; no menos de 96%
Guanina; no menos de 75%
Hipoxantina; no más de 25%
6.1.22 Henna
6.1.22.1 Físicas
Sinónimos: CI Natural Orange No. 6
Número de Código: CI 75480
Color: Naranja a rojo
6.1.22.2 Pureza
Humedad; no más de 10%
Cenizas totales; no más de 15%
Cenizas ácidas insolubles; no más de 5%
Plomo (como Pb); no más de 20 ppm
Arsénico (como As); no más de 3 ppm
6.2 Microbiológicas
Los colorantes objeto de esta Norma deberán estar exentos de microorganismos patógenos.
7 MUESTREO
El procedimiento de muestreo para los productos objeto de esta Norma se sujeta a lo que establece la Ley General de Salud.
8 METODOS DE PRUEBA
Para la verificación de las especificaciones químicas que se establecen en esta Norma, se deben aplicar las Normas Oficiales Mexicanas que se indican en el apartado de referencias; en el caso de determinaciones específicas se aplicará la metodología correspondiente, establecidos en los Apéndices Normativos.
9 ETIQUETADO
Los envases que contengan colorantes orgánicos naturales deberán contener una etiqueta que cumpla con lo establecido en el Reglamento y la Norma Oficial Mexicana correspondiente, incluyendo además la siguiente información:
9.1 Color Index (en su caso);
9.2 Nombre químico;
9.3 Declaración de pureza,
10 ENVASE Y EMPAQUE
10.1 Envase
Los colorantes orgánicos naturales se deben envasar en recipientes de tipo sanitario, elaborado con materiales inocuos y resistentes a distintas etapas del proceso, de tal manera que no reaccionen con el producto y/o alteren las características físicas y químicas del mismo.
10.2 Empaque
Se deben usar envolturas de material resistente y que ofrezca la protección adecuada a los envases para impedir su deterioro exterior, a la vez que faciliten su manipulación, almacenamiento y distribución.
11 CONTROL
Cada lote de producción deberá estar respaldado por un certificado de análisis del productor y hoja de identidad, con las especificaciones establecidas en esta Norma. Esta información estará a disposición del consumidor que la solicite.
12 OBSERVANCIA DE LA NORMA
La vigilancia en el cumplimiento de la presente Norma corresponde a la Secretaría de Salud.
13 CONCORDANCIA CON NORMAS INTERNACIONALES
Esta Norma no tiene concordancia con normas internacionales.
14 BIBLIOGRAFIA
14.1 Ley General de Salud. Secretaría de Salud. Diario Oficial de la Federación 14 de Junio 1991.
14.2 Reglamento de la Ley General de Salud en Materia de Control Sanitario de Actividades, Establecimientos, Productos y Servicios. Secretaría de Salud. Diario Oficial de la Federación. 18 Enero 1988.
14.3 Code of Federal Regulations 21 (1990) The Office of Federal Register National Archives and Record Administration. USA.
14.4 Association of Analylitical Chemists. 1990. Official Methods of Analysis. Vol. 1, 15th. Edition. USA.
14.5 Committee on CODEX Specifications. 1981. Food Chemicals Specifications. 3rd. Edition. National Academic Press. Washington, USA.
14.6 Cosmetic, Toiletry and Fragance Association Inc. 1983. CTFA Compendium of Cosmetic Ingredient Composition. 5th. Edition. CTFA. Washington, USA.
14.7 Food and Agriculture Organization of the United Nations. 1988. FAO Food and Nutrition Paper. No. 5 Rev 2. Guide to specifications. Rome, Italy.
14.8 Food and Agriculture Organization of the United Nations. 1988. FAO Food and Nutrition Paper. No. 38 Specifications for identity and purity of certain food additives. Rome, Italy.
14.9 Food and Agriculture Organization of the United Nations. 1990. FAO Food and Nutrition Paper. No. 49 Specifications for identity and purity of certain food additives. Rome, Italy.
14.10 Marmion D.M. 1991. Handbook of U.S. Colorants Foods, Drugs, Cosmeticas and Medical Devices. Third Edition. John Wiley and Sons, New York. USA.
APENDICE NORMATIVO A
A METODOS DE PRUEBA
1 ACEITE DE ZANAHORIA
1.1 Determinación del índice de yodo
Método del yodo-cloruro
1.1.1 Procedimiento
1.1.1.1 Colocar la muestra, en un matraz, de yodo seco y agregar 20 ml de tetracloruro de carbono y disolver. Agregar 25 ml de solución de yodo-cloruro, tapar el matraz con el tapón previamente humedecido con solución reactivo de yoduro de potasio, dejar reposar en un lugar oscuro a temperatura de 25 ± 5°C, durante 30 minutos, con agitación ocasional.
1.1.1.2 Agregar en el orden mencionado 20 ml de solución reactivo de yoduro de potasio sobre el cono del matraz, cuidadosamente quitar el tapón y enjuagarlo junto con las paredes del matraz con 100 ml de agua recientemente hervida, agitar y titular con solución 0,1M de tiosulfato de sodio, usando casi al final de la titulación solución indicadora de almidón. Anotar los ml consumidos (a).
1.1.1.3 Simultáneamente realizar un blanco de manera similar y anotar los ml consumidos como (b). La diferencia entre los volúmenes en ml de solución 0,1M de tiosulfato de sodio consumidos por el blanco y la muestra, multiplicada por 1,269 y dividida entre el peso de la muestra tomada en gramos es el valor del yodo.
1.1.1.4 El peso aproximado en g que debe usarse para el análisis se puede calcular dividiendo el límite superior del valor del yodo esperado entre 20. Si se consume más de la mitad del halógeno disponible repetir la prueba usando menor cantidad de muestra.
1.2 Determinación del índice de saponificación
1.2.1 Procedimiento
1.2.1.1 Colocar en un matraz con tapón esmerilado de 250 ml de 1,5 a 2 g de la muestra, exactamente pesados, agregar 25 ml de la solución 0,5N de hidróxido de potasio en etanol. Ensamblar al matraz un condensador adecuado, calentar en un baño de vapor, mantener a reflujo durante 30 minutos, agitando por rotación el contenido del matraz.
1.2.1.2 Agregar 1 ml de solución indicadora de fenolftaleína y valorar el exceso de hidróxido de potasio con solución 0,5N de ácido clorhídrico.
1.2.1.3 Correr simultáneamente una prueba en blanco de reactivos usando las mismas cantidades y valorando de la misma manera.
1.2.1.4 Calcular el índice de saponificación por medio de la fórmula siguiente:
S = 28,05[(B - V)/m]; en donde
S = Indice de saponificación de la muestra;
B = Mililitros de la solución 0,5N de ácido clorhídrico gastados en la valoración del blanco;
V = Mililitros de la solución 0,5N de ácido clorhídrico gastados en la valoración de la muestra;
28,05 = miliequivalentes de la solución 0,5N de hidróxido de potasio y
m = Peso en gramos de la muestra.
1.3 Determinación del índice de peróxidos
1.3.1 Procedimiento
1.3.1.1 Pesar con exactitud una cantidad aproximada a 5,0 g de la muestra, transferirlos a un matraz yodométrico de 250 ml, adicionar 30 ml de una mezcla de 3 volúmenes de ácido acético glacial y 2 volúmenes de cloroformo, agitar hasta disolución y adicionar 0,5 ml de solución saturada de yoduro de potasio.
1.3.1.2 Tapar el matraz y dejar reposar la mezcla por 1 minuto exactamente, agitar de vez en cuando; adicionar 30 ml de agua y titular gradualmente con solución 0,01M de tiosulfato de sodio con agitación vigorosa y continuar hasta que casi desaparezca el color amarillo, adicionar 0,5 ml de solución indicadora de almidón y continuar la titulación agitando vigorosamente hasta que desaparezca el color azul.
1.3.1.3 Calcular el blanco de reactivos.
1.3.1.4 Calcular el índice de peróxidos por medio de la fórmula siguiente:
Indice de =1000 M [(a-b)/m]
peróxido
en donde:
a = ml de solución de tiosulfato de sodio gastados en la titulación de la muestra.
b = ml de solución de tiosulfato de sodio gastados en la titulación del blanco.
M = molaridad de la solución de tiosulfato de sodio.
m = peso en gramos de la muestra.
2 ACHIOTE, ANNATO
2.1 Determinación de Annato Soluble en Aceite:
2.1.1 Procedimiento
2.1.1.1 Método A. Disolver 0,1 g de la muestra en cloroformo y diluir con cloroformo en un matraz volumétrico a 100 ml. Determinar el espectro de absorción de la muestra, usando una celda de 1 cm entre 600 nm y 400 nm. Medir la absorbancia en el máximo de absorción cerca de 503 nm y a 404 nm y correr un blanco con solvente.
% de color puro (como bixina)= [A503+A404-0.256 (A503)] (100)
(C)(282,6) (l) (a)
donde:
A = Absorbancia de la solución problema a la longitud de onda indicada.
l = Longitud de la celda patrón (en cm).
a = Concentración de la muestra (en g/l).
0,256 = Factor relacionado con la absorbancia de bixina en
cloroformo a 404 nm y 503 nm.
282,6 = Absortibidad de bixina a 503 nm (en l/g. cm).
2.1.1.2 Método B. Determinar la absorbancia corriendo un blanco de una solución de cloroformo y muestra al máximo a 467 nm. Calcular el porciento de color como bixina usando 320 l/g. cm como la absortibidad.
2.2 Determinación de Annato Soluble en agua:
2.2.1 Procedimiento
2.2.1.1 Disolver 2 g de muestra en solución acuosa de hidróxido de potasio al 5% y medir el máximo de absorbancia a 480 nm.
2.2.1.2 Calcular el porciento de pureza de color como bixina usando 287 l/g. cm como la absortibidad.
2.3 Determinación de Annato, Emulsiones:
2.3.1 Procedimiento
2.3.1.1 Disolver la muestra en cloroformo 1:1 v/v. Ajustar acidificando con unas gotas de ácido acético glacial, y medir nuevamente la absorbancia del mismo solvente a la máxima absorción 500 nm.
2.3.1.2 Calcular el porciento de pureza de color, usando 287 l/g. cm como la absortibidad.
3 AZAFRAN
3.1 Determinación de cenizas
En una cápsula previamente tarada, se pesan exactamente 5 g de azafrán y se introduce en una estufa de desecación a temperatura de 100-105°C, manteniéndola hasta peso constante. El residuo se somete a calcinación a temperatura no superior al rojo sombra (alrededor de 525°C). El exceso de peso sobre la tara del crisol o cápsula, multiplicado por 20, da el porcentaje de cenizas.
3.2 Determinación de colorantes extraños
3.2.1 Tratar una pequeña cantidad de azafrán con bencina. No debe ceder color alguno; en caso de hacerlo puede sospecharse la presencia de ácido pícrico o derivados del alquitrán
3.2.2 Hervir una pequeña cantidad de azafrán con cianuro potásico y potasa, la aparición de color rojo púrpura revela la presencia de ácido pícrico.
4APO 8 CAROTENAL
4.1 Identificación
Determinar la absorbancia de la solución B preparada directamente a 488 nm y 460 nm. El radio A488/A460 está entre 0,77 y 0,85.
Determinar la absorbancia de la solución B a 460 nm y de la solución A a 332 nm. El radio A332/(10 X A460) está entre 0,063 y 0,075.
Solución A. Transferir 40 mg de la muestra, exactamente pesada, dentro de un matraz volumétrico de 100 ml, disolver en 10 ml de cloroformo libre de ácido, diluir a volumen con ciclohexano y mezclar. Tomar 2 ml de esta solución con pipeta y colocarla en un matraz volumétrico de 50 ml, diluir a volumen con ciclohexano y mezclar.
Solución B. Tomar con una pipeta 5 ml de la solución A y colocarla en un matraz volumétrico de 50 ml, diluir a volumen con ciclohexano.
4.2 Procedimiento:
4.2.1 Determinar la absorbancia de la solución B en una celda de 1 cm en un máximo de absorción de longitud de onda de 460 nm con espectrofotómetro, usando ciclohexano como blanco.
4.2.2 Calcular la cantidad en mg de C30H40O en la muestra mediante la siguiente fórmula:
25000 A/264
en el cual A es la absorbancia de la solución y 264 es la absortibidad de -apo-8'-carotenal puro.
5 BETANINA
5.1 Determinación de porciento de color en Betanina
5.1.1 Reactivos:
Solución Buffer (pH 5)
5.1.2 Procedimiento:
5.1.2.1 Disolver una cantidad pesada correctamente en una solución buffer y diluir a un volumen conveniente con la solución buffer (V total en ml); la absorción máxima puede ser en el rango de 0,2 a 0,8.
5.1.2.2 Centrifugar la solución, si es necesario, y medir la absorción corrigiendo con un blanco compuesto de solución buffer (pH5).
5.1.2.3 El contenido de color está calculado en las bases de la máxima absorción A (a 530 nm) usando la absorbancia específica para Betanina.
A 1%=1120
1 cm
% color rojo (C) =A * V
1120 * L X W
en donde:
A = absorbancia máxima
V = volumen de solución probada medida en ml
L = longitud de la celda medida en cm
W = peso de muestra en g
5.2 Determinación de Nitratos en Betanina
5.2.1 Reactivos
Solución estándar de nitrato - (10,000 mg/l)
Disolver 16,31 g de nitrato de potasio (KNO3), previamente secado a 105°C por 24 horas en 1000 ml de agua.
Solución Buffer. Disolver 6,66 g de sulfato de aluminio octahidratado, Al2(SO4)3 . H2O, 3,12 g de sulfato de plata (Ag2SO4), 1,24 g de ácido bórico (H3BO3) en 900 ml de agua, ajustar a pH 3,0 con ácido sulfúrico 1 M y diluir con agua a 1000 ml.
Solución buffer diluida. Diluir la solución estándar con la solución buffer diluida, preparar en orden las siguientes soluciones: 0, 100, 200, 300, 400, 500 mg nitrato/l.
5.2.2 Procedimiento:
5.2.2.1 Pesar exactamente 0,5 g de la muestra en un matraz Erlenmeyer, adicionar 50 ml de solución buffer diluida y disolver con agitación.
5.2.2.2 Medir el potencial de la solución calibrada y también de la solución problema.
5.2.2.3 Trazar la curva de calibración usando papel antilogarítmico, marcando en las abcisas la concentración de nitrato. De la curva de calibración, leer la concentración de nitrato de la muestra.
Cálculos:
Contenido de Nitrato =a g/g de materia colorante.
200 W C
donde:
a = Concentración de nitrato de la muestra, mg/l
W = Peso de la muestra
C = % color rojo calculado
6CAROTENO
6.1 Determinación decaroteno ( Soluble en agua fría)
6.1.1 Procedimiento
6.1.1.1 Pesar exactamente 120 mg de la mezcla en un matraz volumétrico de 250 ml. Adicionar 5 ml de agua destilada y tratar con ultrasonido a máximo de 60°C por aproximadamente 10 minutos.
6.1.1.2 Enfriar la solución bajo una corriente de agua fría, adicionar 100 ml de etanol absoluto, mezclar y llevar a volumen con dietil éter.
6.1.1.3 Centrifugar 50 ml de esta solución turbia por 5 minutos. Tomar una alícuota de 5 ml de la solución clara y colocarla en un matraz volumétrico de 100 ml, evaporar a sequedad en un rotovapor a 50°C.
6.1.1.4 Después de enfriar lavar el residuo con 1 ml de etanol absoluto y diluir a 100 ml con ciclohexano (solución a medir).
6.1.1.5 Con un espectrofótometro adecuado (e.g. ZEISS PMQ3, con banda de amplitud de aproximadamente 1 nm) medir la absorbancia de la solución final a 454 nm contra ciclohexano, usando celdas de cuarzo de 1 cm.
Contenido de B-caroteno % = A454*5000
________________
2230* W
donde:
A454 = Absorbancia de la solución final a 454 nm
W = Peso de la muestra
2230 = Absorbancia de referencia (1%, 1 cm)
5000 = Factor de dilución
6.2 Determinación decaroteno en emulsión
6.2.1 Procedimiento
6.2.1.1 Pasar exactamente 100 mg de la muestra a un matraz volumétrico de 100 ml. Adicionar 25 ml de agua destilada y tratar con ultrasonido por 5 minutos a 20°C. Adicionar 2 ml de HCl N, 5 ml de etanol y 50 ml de cloroformo.
6.2.1.2 Agitar por 20 minutos y centrifugar por 10 minutos. Decantar la solución sobrenadante, tomar 5 ml de ésta y transferirla a un matraz volumétrico de 50 ml y llevar a volumen con ciclohexano.
6.2.1.3 Con espectrofotómetro adecuado medir la absorción de la solución final a 454 nm, usando ciclohexano como blanco.
Calcular el contenido en base a E(1%,1cm)=2230, el cual es el valor teórico correspondiente al radio de isomería presentes en el producto.
7 CANTAXANTINA
7.1 Determinación de cenizas sulfatadas
7.1.1 Procedimiento
7.1.1.1 Transferir 2 g de muestra a un crisol previamente tarado de platino u otro contenedor de material apropiado de 50 o 100 ml y añadir suficiente ácido sulfúrico diluido TS para humedecer totalmente la muestra.
7.1.1.2 Calentar suavemente usando una parrilla o un mechero Argand, o una lámpara infrarroja, hasta que la muestra esté perfectamente seca, continuar calentando hasta que toda la muestra ha sido carbonizada y enfriar.
7.1.1.3 Humedecer el residuo con 0,5 ml de ácido sulfúrico concentrado y calentar de la misma manera hasta que los restos de la muestra y el exceso de ácido sulfúrico han sido volatilizados.
7.1.1.4 Finalmente incinerar en una mufla calentando a 800°± 25°C por 15 minutos o más si es necesario, hasta completar la ignición, enfriar en un desecador y pesar.
(Nota: En el periodo en que se promueve la volatilización de ácido sulfúrico, se aconseja añadir algunos fragmentos de carbonato de amonio justamente antes de completar la ignición)
8 COLOR CARAMELO
8.1 Determinación de Nitrógeno Amoniacal:
8.1.1 Equipo/reactivos
2 mantillas de calentamiento
2 matraces balón de 300 ml con junta 24/40
2 destiladores Kjeldahl
Perlas de ebullición
2 vasos de precipitados de 230 ml
Hidróxido de sodio 0,5N
Acido clorhídrico 0,05N
Oxido de magnesio
Indicador rojo de metilo
Antiespumante
8.1.2 Procedimiento
8.1.2.1 Pesar cuidadosamente 3,0 g de muestra y transferirla al matraz balón con 200 ml de agua destilada. Adicionar 2 g de óxido de magnesio, 2-3 gotas de antiespumante y perlas de ebullición.
8.1.2.2 Preparar el blanco de reactivos, colocar 200 ml de agua destilada, 2 g de óxido de magnesio, 2-3 gotas de antiespumante y perlas de ebullición.
8.1.2.3 En 2 vasos de precipitados, colocar en cada uno 25 ml de ácido clorhídrico 0,05N con 2 gotas de indicador rojo de metilo, siendo éstos los vasos receptores.
8.1.2.4 Conectar el matraz balón con el refrigerante y asegurarse que la descarga del refrigerante esté por debajo del nivel de ácido en el vaso receptor.
Trabajar simultáneamente la muestra y el blanco de reactivos.
8.1.2.5 Someter a calentamiento hasta que por destilación se hayan colectado aproximadamente 100 ml de líquido.
8.1.2.6 Titular el contenido del vaso receptor a pH 6,2 con NaOH 0,05N
8.1.2.7 Calcular el porcentaje de Nitrógeno amoniacal
% de Nitrógeno=[ml de HCl* N HCl]-[ml de NaOH*N NaOH]*1,4007
amoniacalPeso de la muestra
8.2 Determinación de 4 metil imidazol
8.2.1 Equipo/ reactivos
Cromatógrafo de gases, equipado con detector de hidrógeno con ionización de flama, columna de vidrio silanizada empacada con 7,5% de carbowax 20M + 2% de KOH sobre una malla 90/100 Anakrom ABS
Tubo de vidrio para cromatografía 22 x 300 mm con llave de teflón removible
Matraces volumétricos 5, 10, 50 ml
Embudo de plástico 100 mm de diámetro
Matraz balón de 300 ml
Vaso de precipitados de plástico
Aparato de destilación
Pipetas Pasteur
Fibra de vidrio Pyrex
Evaporador rotatorio al vacío
Diclorometano
2 metilimidazol
4 metilimidazol
Tetrahidrofurano o acetona
Hidróxido de sodio 3,0 N (disolver 120 g en 1 l de agua destilada)
Celite 545 o equivalente
8.2.2 Procedimiento
8.2.2.1 Purificación de reactivos
Técnica de estándar externo. Purificar los cristales del 4-metilimidazol grado reactivo sometido a destilación al vacío (punto de ebullición 92-93°C y 0,05 mm Hg)
8.2.2.2 Preparación de soluciones estándar
Pesar cuidadosamente 50 mg del reactivo antes purificado colocar en un matraz aforado de 50 ml y disolver con tetrahidrofurano o acetona hasta obtener el volumen.
Tomar de cada matraz alícuotas de 0,25, 0,50, 1,0, 1,5, 2,0, 3,0, 3,5, 4,0, y 5,0 ml y colocarlas en matraces aforados de 10 ml cada una, adicionar tetrahidrofurano o acetona hasta obtener el volumen. Las soluciones estándares preparadas representan concentraciones de 25, 50, 100, 150, 100, 250, 300, 350, 400, y 500 mg/k de 4 metilimidazol. Refrigerar las soluciones.
8.2.2.3 Preparación de la muestra
8.2.2.3.1 Pesar 10,0 g de color y 5,0 g de NaOH 3N, colocarlos en el vaso de plástico, mezclar perfectamente. El pH de la mezcla no debe ser mayor a 12.
8.2.2.3.2 Adicionar 20,0 g de celite 545 o equivalente y mezclar con una espátula de acero inoxidable hasta que esté homogénea, es decir que el color sea uniforme. La mezcla queda semiseca.
8.2.2.3.3 Taponar con fibra de vidrio Pyrex la parte interior del tubo para cromatografía de 22 x 300 mm, transferir totalmente la mezcla anterior con ayuda del embudo de plástico y taponar con fibra de vidrio la parte superior del tubo.
8.2.2.3.4 Acomodar el contenido, dejando caer verticalmente el tubo hasta que queden 10 cm de distancia entre el tope y la superficie empacada. La cama del tubo debe tener 15 cm de altura y ser uniforme para permitir que la elución ocurra rápidamente.
8.2.2.3.5 Enjuagar el vaso con diclorometano (eluyente) e inundar el tubo abriendo la llave de teflón hasta que el líquido quede al nivel de la llave, cerrar la llave y dejar que el eluyente esté en contacto con la cama durante 5 minutos.
8.2.2.3.6 Abrir la llave y colectar en el matraz balón 200 ml del eluyente a un flujo de 5 ml por minuto.
8.2.2.3.7 Remover el eluyente (diclorometano) sometido a destilación al vacío a 35°C y 45-50 KPa, hasta reducir el volumen a 1 ml. Precaución: durante el paso de concentración, observar el matraz para asegurarse que no ocurra ruptura del mismo.
8.2.2.3.8 Con una pipeta Pasteur, transferir el extracto a un matraz aforado de 5 ml, enjuagar con porciones de 0,75 ml de tetrahidrofurano hasta obtener el volumen. Mezclar perfectamente, a esto le denominaremos muestra.
8.2.2.3.9 Cromatografía de gas
Condiciones de operación:
Temperatura de la columna190°C (isotérmica)
Temperatura puerto de inyección200°C
Temperatura del detector250°C
Gas acarreadorNitrógeno
Flujo50 ml/minuto
Tamaño de muestra5 µl
Técnica estándar externo
8.2.2.3.9.1 Determinación de la curva estándar
Inyectar 5,0 µl de cada solución estándar preparadas con 4 metilimidazol y obtener los cromatogramas.
8.2.2.3.9.2 Para cada cromatograma estándar, calcular el área de pico corregida, multiplicando la altura del pico (en mm) por el ancho a la mitad de la altura del pico (en mm) por la correspondiente atenuación y por el factor dependiendo del aparato en particular y los parámetros de operación utilizados.
8.2.2.3.9.3 Graficar las áreas de pico corregidas contra sus respectivas concentraciones de4 metilimidazol y obtener así la curva.
8.2.2.3.9.4 Inyectar 5,0 µl de la muestra de la misma manera que las soluciones estándar. Calcular el área del pico a interpolar para obtener el contenido de 4 metilimidazol en la muestra.
8.3 Determinación de dióxido de azufre por el método Mornier- Williams modificado.
8.3.1. Equipo/ reactivos
Equipo Mornier-Williams modificado según la figura 1 anexa
Peróxido de hidrógeno al 3% preparado recientemente
Indicador rojo de metilo
Acido pirogálico
Hidróxido de potasio
Acido clorhídrico 4 N
Hidróxido de sodio 0,05 N
Gas nitrógeno
Agente antiespumante
8.3.2 Procedimiento
8.3.2.1 Preparación de la muestra
8.3.2.1.1 Instalar el equipo como se muestra en la figura 1.
Nota: es recomendable tener 2 equipos montados, ya que uno se utilizará para la muestra y el otro para el blanco de reactivos.
8.3.2.1.2 Para cada tubo receptor adicionar 10 ml de peróxido de hidrógeno al 3% y 3 gotas del indicador rojo de metilo.
8.3.2.1.3 Purgar el sistema con nitrógeno durante 5 minutos, verificar que no haya fugas en las juntas y utilizar las pinzas para asegurar la instalación.
8.3.2.1.4 En el matraz de destilación colocar 40 g de muestra y utilizar 400 ml de agua destilada para transferirla. Adicionar una gota de antiespumante.
8.3.2.1.5 En un segundo matraz de destilación preparar el blanco adicionando 400 ml de agua destilada y 1 gota de antiespumante.
8.3.2.1.6 Preparar las botellas de gas lavador adicionando a cada una de ellas una solución de piroganol (4,5 g de piroganol disuelto en 15 ml de agua destilada).
8.3.2.1.7 Purgar el sistema con nitrógeno durante 15 minutos, adicionar una solución de KOH (65 g de KOH disueltos en 85 ml de agua) a cada botella de gas lavador y de nuevo purgar con nitrógeno.
8.3.2.1.8 Adicionar a los matraces de destilación 90 ml de ácido clorhídrico 4 N mientras se continúa purgando el sistema.
8.3.2.1.9 El flujo de nitrógeno debe ser ajustado de manera que en las botellas lavadoras de gas se observe una corriente suave y constante de burbujas.
8.3.2.1.10 Suministrar agua al refrigerante y someter a calentamiento los matraces de destilación para causar reflujo durante 25 minutos (90 voltios). Cuando se obtiene un reflujo continuo suministrar más calor (120 voltios) y reflujar durante 105 minutos.
8.3.2.1.11 Quitar el agua a los refrigerantes y continuar calentando hasta que el primer adaptador muestre algo de condensación.
8.3.2.1.12 Suspender el suministro de calor y el flujo de nitrógeno, quitar el tubo receptor y vaciar su contenido en un vaso de precipitado de 250 ml. Enjuagar el tubo receptor con agua destilada y vaciar el agua en el mismo vaso de precipitados.
8.3.2.1.13 Enjuagar cada una de las partes del sistema (refrigerante, adaptador, primer condensador, concentrador) con agua destilada y vaciarla en el vaso de precipitados (utilizar aproximadamente 175 ml)
8.3.2.1.14 Titular todo el contenido del vaso de precipitado con hidróxido de sodio 0,05 N adicionando unas gotas de rojo de metilo hasta que vire a amarillo claro pH 6,2
8.3.2.1.15 Calcular el porcentaje de SO2 con la siguiente fórmula.
%SO2 = (ml de NaOH)(N del NaOH)(3,205)
gramos de muestra
9 COCHINILLA O CARMIN
9.1 Determinación de ácido carmínico
9.1.1 Material:
Matraz aforado de 1 litro
Vaso de precipitado de 250 ml
Acido clorhídrico 2 N
9.1.2 Preparación de la muestra
La muestra de rojo carmín se hidroliza con ácido clorhídrico para liberar todo el ácido carmínico y su absorbancia a una longitud de onda de 494 nm.
9.1.3 Procedimiento:
9.1.3.1 Pesar exactamente 0,10 g de muestra en un vaso de precipitado de 250 ml, adicionar 30 ml de HCl 2N y calentar a ebullición en baño maría durante 3-4 minutos, vaciar cuantitativamente esta mezcla en un matraz aforado de 1 litro y aforar con agua destilada.
9.1.3.2 Prepare un blanco de reactivo con ácido clorhídrico 2 N y agua destilada en parte proporcional a lo usado para analizar la muestra. Leer la absorbancia de la solución en un espectrofotómetro a una longitud de onda de 494 nm.
9.1.3.3 Calcular el porcentaje de ácido carmínico de acuerdo a la siguiente fórmula:
% Acido carmínico= A * 100
13,9 * b * W
Donde:
A =Absorbancia (valor leído a 494 mn)
b =Espesor de la celda
13,9 =Factor
W =Peso de la muestra en gramos
10 CURCUMA
10.1 Determinación de curcumina
10.1.1 Reactivos:
Acetona.
Estándar de Curcumina para síntesis (C21 H2O 06)
M = 368,37 g/mol de Merck.
10.1.2 Preparación del estándar:
Colocar 250 mg de curcumina estándar pesados exactamente en un matraz volumétrico de 100 ml, anotar el peso en mg como w.
Disolver en acetona, diluir a volumen con acetona hasta el aforo y mezclar.
Tomar un mililitro de esta solución y colocar en un segundo matraz de 100 ml llevar el aforo y mezclar, finalmente pipetear 5 ml de la solución anterior, y colocarla en un matraz volumétrico de 50 ml, diluir en acetona, llevar al aforo y mezclar.
10.1.3 Preparación de la muestra
Colocar 250 mg de muestra exactamente pesada dentro de un matraz volumétrico de 100 ml, anotar el peso en mg como W.
Disolver en acetona, diluir a volumen con acetona hasta el aforo y mezclar.
Tomar 1 ml de esta solución y colocar en un segundo matraz de 100 ml, llevar el aforo y mezclar finalmente, pipetear 5 ml de la solución anterior, y colocarla en un matraz volumétrico de 50 ml, diluir en acetona, llevar al aforo y mezclar.
10.1.4 Procedimiento:
Determinar la absorbancia de cada solución a 418 nm en una celda de 1 cm, usando como blanco acetona.
Calcular el porciento de curcumina en la muestra con la siguiente fórmula:
100 * (w/W) * (Au/As)
En donde:
Au = (Absorbancia de la muestra)
As = (Absorbancia del estándar de curcumina)
w = (Peso del estándar en mg)
W = (Peso de la muestra en mg)
NOTA: Las lecturas de absorbancia deben realizarse lo más pronto posible después de ser preparadas las soluciones para evitar pérdidas en el color.
11 HARINA DE SEMILLA DE ALGODON COCIDA, TOSTADA Y PARCIALMENTE DESGRASADA
11.1 Determinación del contenido de gosipol libre
11.1.1 Procedimiento
11.1.1.1 Pesar 1 g de la muestra y transferirla a un matraz Erlenmeyer de 250 ml.
11.1.1.2 Recubra el fondo del matraz con perlas de vidrio de 6 mm de diámetro. Transferir 50 ml de una solución de acetona - agua (7:3) al matraz, tapar y agitar en un agitador mecánico durante 1 hora. Filtre esta solución a través de un papel filtro seco de porosidad media, recibiendo en un matraz pequeño, y descarte los primeros ml del filtrado.
11.1.1.3 Tomar 2 porciones de 10 ml del filtrado y depositarlos en matraces volumétricos de 25 ml. Diluir la primera porción a volumen con una solución de alcohol isopropílico - agua (8:2).
11.1.1.4 A la segunda alícuota agregar 2 ml de anilina redestilada y calentar en baño maría por 30 minutos. Calentar en baño maría una solución conteniendo 2 ml de anilina y 10 ml de una solución acetona - agua (7:3), quitar ambas soluciones del baño, enfriar a temperatura ambiente, y diluirlo a volumen con una solución de alcohol isopropílico - agua (8:2).
11.1.1.5 Medir la absorbancia de las 2 soluciones muestra y del reactivo contra el alcohol isopropílico a un máximo cercano a 460 nm.
11.1.1.6 Calcule la absorbancia corregida (diferencia entre la absorbancia de las muestras, corregidas con el blanco) y compare contra estándares preparados de manera similar.
12 OLEORRESINA DE PAPRIKA
12.1 Determinación de capsaicina
12.1.1 Procedimiento
12.1.1.1 Pesar exactamente 5 g en un matraz, adicionar 100 ml de metanol al 70 %, agitar por 30 minutos. Dejar reposar la solución por 5 minutos y filtrar. Tapar el embudo para evitar la evaporación.
12.1.1.2 Los primeros 25 ml del filtrado se descarta y el resto del filtrado se mezcla bien. Distribuir esta solución en matraces de 100 ml y prepararlos de la siguiente manera:
Matraz 1Matraz 2Matraz 3Matraz 4
Solución filtrada4,00 ml4,00 ml----
Agua destilada17,80 ml16,80 ml19,00 ml18,00 ml
HCl 1 N1,00 ml--1,00 ml--
NaOH 1 N--2,00 ml--2,00 ml
Valor DeterminadoA1A2A3A4
12.1.1.3 Las soluciones se mezclan en los matraces con 100 ml de metanol.
12.1.1.4 La absorbancia se valúa A1-A4 , las 4 soluciones son medidas a 248 nm y 296 nm (lámpara de deuterio, celda de cuarzo).
Cálculos:
a) a 248 nm [(A2-A1)-(A4-A3)]X[2500] =% capsaicina
314 X W
b) a 296 nm [(A2-A1)-(A4-A3)]X[2500] =% capsaicina
127 X W
2500 = dilución
314 y 127 = factores de corrección.
W = Peso de la muestra en gramos
Determinaciones réplicas de (a) y (b) no pueden diferir mas de 10%. Puede repetirse esta determinación
12.2 Determinación de ASTA (American Spice Trade Association). Valuar el color conforme el siguiente procedimiento:
12.2.1 Aparatos:
Espectrofotómetro, capaz de medir exactamente la absorbancia a 460 nm.
Celdillas de absorción cuadradas de 1 cm con tapón.
Matraces volumétricos con tapón de vidro esmerilado.
Pipetas de vidrio de 10 ml.
Papel glassine.
Papel filtro Watman No. 40 o equivalente.
12.2.2 Reactivos:
Acetona grado técnico
Cristales de Sulfato de amonio y cobalto.
Dicromato de Potasio grado reactivo.
El sulfato de amonio y cobalto debe secarse una semana en un desecador conteniendo sulfato de calcio anhidro. No es necesario un tratamiento preliminar para el dicromato de potasio.
Solución estándar de color: 0,3005 g/l de dicromato de potasio, más 34,96 g/l de cristales de sulfato de amonio y cobalto en una solución de ácido sulfúrico 1,8 m. La absorbancia de esta solución (As) en una celdilla de 1 cm. a 460 nm podría ser 0,600.
12.2.3 Procedimiento
12.2.3.1 Pesar exactamente una muestra de 50 a 80 mg en un matraz volumétrico de 100 ml y diluir con acetona hasta la marca. Hacer la extracción en un mínimo de 15 minutos, agitando ocasionalmente.
12.2.3.2 Con una pipeta de 10 ml, transferir 10 ml del extracto en otro matraz volumétrico, y diluir hasta la marca con acetona.
12.2.3.3 Filtrar el extracto diluido usando papel Whatman No. 40; desechar 10 a 15 ml del primer filtrado. Decantar una porción del filtrado en una celdilla y medir la absorbancia a 460 nm, usando acetona como blanco.
12.2.3.4 Determinar la absorbancia (As) de la solución estandar de color a 460 nm.
Cálculos:
C = A *164*If
W
donde:
C = Valor de color extraido ASTA
A = Absorbancia de extracto de acetona a 460 nm
W = peso de la muestra en gramos
If= 0,600/As longitud de la celda y factor de corrección del instrumento.
As= Absorbancia de la solución estándar
12.3 Determinación de solventes residuales
Este procedimiento es para la determinación de residuos de acetona, dicloruro de etileno, hexano, isopropanol, metanol, diclorometano y tricloroetileno.
12.3.1 Aparatos
Cabeza de destilación.
Trampa Clevenger diseñada para usarse con aceites más pesados que el agua. Diseño en la figura No. 2
12.3.2 Reactivos y Soluciones
Tolueno. El tolueno usado para este análisis no debe contener alguno de los solventes a determinar por este método. La pureza puede determinarse por cromatografía de gas utilizando una de las siguientes columnas o sus equivalentes:
17% en peso de UCON 75-H-90 000 sobre una malla 35/80 de Chromosorb W;
20% de UCON LB-135 sobre una malla 35/80 Chromosorb W;
15% de UCON LB-1715 sobre una malla 60/80 Chromosorb W;
Porapak Q sobre una malla de 50/60.
Siga las condiciones descritas en el procedimiento e inyecte la misma cantidad de tolueno como la inyectora en el análisis de los solventes. Si las impurezas interfieren con la prueba aparecerán como picos presentes antes del pico del tolueno y podrían ser removidos por destilación fraccionada.
Benceno.
El benceno usado para este análisis debe estar libre de impurezas que interfieran; la pureza puede ser determinada como se describió para tolueno.
Detergente y Antiespumante
Deben ser utilizados productos libres de compuestos volátiles. Si estos compuestos están presentes, pueden ser removidos por ebullición prolongada de las soluciones acuosas de los productos.
12.3.2.1 Solución de referencia A
Prepare una solución de tolueno conteniendo 2,5g/kg de benceno. Si el tolueno disponible contiene benceno como única impureza el nivel de este último puede ser determinado por cromatografía de gas y agregue suficiente benceno hasta alcanzar el nivel o la concentración de 2,5g/kg.
12.3.2.2 Solución de referencia B
Prepare una solución conteniendo 0,63% v/p de acetona en agua.
12.3.2.3 Preparación de muestra A (Todos los solventes excepto metanol)
Coloque 50 g de la muestra, 1 ml de la solución de referencia A, 10 g de Na2SO4 anhidro, 50 ml de agua y una pequeña cantidad de detergente y antiespumante en un matraz de fondo redondo con un cuello de vidrio rugoso (de grano) de 20/40. Fije la cabeza de destilación a un condensador enfriado por agua de 400 ml y a un recipiente, recupere aproximadamente 15 ml del destilado. Agregue al destilado 15 g de K2CO3 anhidro, agite mientras enfría y permita la separación de fases. Todos los solventes excepto metanol estarán presentes en la fase de tolueno, la cual es usada en el procedimiento.
Separe la fase acuosa para usarla en la preparación de la muestra B.
12.3.2.4 Preparación de la muestra B (sólo metanol)
Coloque la fase acuosa obtenida de la preparación de la muestra A en un matraz de destilación de fondo redondo de 50 ml con el cuello de vidrio rugoso 24/40, agregue unas cuantas piedras de ebullición y 1 ml de la solución de referencia B y recuperar aproximadamente 1 ml del destilado, el cual contendrá algo de metanol de la muestra junto con acetona como un patrón interno (de referencia). El destilado se usa en el procedimiento.
12.3.3 Procedimiento
12.3.3.1 Use un equipo de cromatografía de gas con un detector eléctrico y un sistema de inyección de muestra o inyección en columna. En condiciones típicas, el instrumento contiene una columna de 63 mm (OD) por 183 a 244 cm, mantenida isotérmicamente entre 70 y 80 °C. La tasa de flujo del gas acarreador es de 50 a 80 ml/min y el tamaño de la muestra es de 15 a 20 microlitros (para el detector eléctrico).
12.3.3.2 Las columnas A, B, C y D como se describen en tolueno pueden ser usados como sigue:
A Esta columna separa acetona y metanol de sus respectivas soluciones acuosas. Puede ser usada para separar y analizar hexano, acetona incluso etileno en la fase de tolueno a partir de preparación de muestra A. El orden de elución es acetona, metanol, agua o hexano, acetona, isopropanol más diclorometano, benceno más tricloroetileno más tolueno.
B Esta columna separa diclorometano e isopropanol. El orden de elución es Hexano más acetona, diclorometano, isopropanol, benceno, tricloroetileno, tolueno.
C Esta es la mejor columna para propósitos generales, excepto para la determinación de metanol. El orden de elución es hexano, acetona, benceno y tolueno.
D Esta columna es usada para la determinación de metanol el cual eluye justo antes del pico grande de agua.
12.3.3.3 Calibración.
Determine la respuesta del detector para radios conocidos de solventes por medio de la inyección de mezclas conocidas de solventes y de benceno en tolueno. Los niveles de solvente y de benceno en tolueno deberán ser de la misma magnitud que los presentes en la muestra bajo análisis.
12.3.3.4 Cálculo.
Calcule las áreas de los solventes respecto al benceno y después calcule el factor de calibración F como sigue:
F (solvente)= Peso del solvente * Area del benceno
Peso del benceno Area del solvente
La recuperación de varios solventes de la muestra respecto a la recuperación del benceno es como sigue:
Hexano52%
Acetona85%
Isopropanol100%
Diclorometano87,5%
Tricloroetileno113%
Metanol87%
Calcule los mg/kg de solventes residuales (excepto metanol) por la siguiente fórmula:
Solvente = 43,4 x F (solvente) x 100 x Area del solvente
residual Porcentaje de recupera-Area de benceno
ción de solvente
donde:
43.4 = mg/kg del patrón interno de benceno relacionado a 50 g de muestra para análisis
Calcule los mg/kg de metanol residual por la fórmula:
Metanol residual = 100 F x Area del metanol
0,87Area acetona
donde:
100 = Concentración en mg/kg del patrón interno de acetona relacionado a una muestra de 50 g
F = Factor de calibración para metanol determinado por el uso de una mezcla conocida de metanol y acetona
13 RIBOFLAVINA 5 FOSFATO
13.1 Determinación de fosfato
13.1.1 Reactivos
Preparación del estándar
Transferir 220 mg de fosfato monobásico de potasio KH3PO4 a un matraz volumétrico de 1000 ml, disolver y diluir a volumen con agua y mezclar. Transferir 20 ml de esta solución a un matraz volumétrico de 100 ml, diluir a volumen con agua y mezclar.
Preparación de la prueba
Tranferir 300 mg de la muestra a un matraz volumétrico de 100 ml, disolver y diluir a volumen con agua y mezclar.
Solución ácida de molibdato.
Diluir 25 ml de una solución de molibdato de amonio ( 7 g de (NH4)6Mo7O24.4H2O en suficiente agua para hacer 100 ml) en 200 ml de agua y adicionar lentamente 25 ml de ácido sulfúrico 7,5 N.
Solución de sulfato ferroso
Justo antes de usarse, prepare una solución acuosa al 10% de sulfato ferroso conteniendo 2 ml de ácido sulfúrico 7,5 N por 100 ml de solución final.
13.1.2 Procedimiento
13.1.2.1 Transferir 10 ml de la preparación estándar y de la preparación de prueba en matraces Erlenmeyer de 50 ml separados, adicionar 10 ml de la solución ácida de molibdato y 5 ml de la solución de sulfato ferroso a cada matraz y mezclar.
13.1.2.2 Determinar la absorbancia de cada solución en una celda de 1 cm a 700 nm con espectrofotómetro, usando como blanco una mezcla de 10 ml de agua, 10 ml de la solución ácida de molibdato y 5 ml de la solución de sulfato ferroso.
13.1.2.3 La absorbancia de la solución de prueba no es mayor que la de la preparación estándar.
13.3 Determinación de riboflavina libre y riboflavina difosfato.
13.3.1 Reactivos
Preparación del estándar
Transferir 35 mg de riboflavina estándar de referencia en un matraz Erlenmeyer de 250 ml, adicionar 20 ml de piridina y 75 ml de agua y disolver la riboflavina por agitación frecuente. Transferir la solución a un matraz volumétrico de 1000 ml y diluir a volumen con agua y mezclar. Transferir 20 ml de esta solución a un segundo matraz volumétrico, ajustar el pH a 6 con la adición de 8 ml de ácido sulfúrico 0,1N, diluir a volumen con agua y mezclar. Finalmente, transferir 25 ml de la última solución a un matraz volumétrico de 100 ml, diluir a volumen con una mezcla de dioxano - agua (1:3), y mezclar. Esta solución contiene 0,175 mg de riboflavina por mililitro.
pH Solución buffer.
Disolver 15,6 g de fosfato monopotásico (Na H2 PO4 2H2O) en 100 ml de agua, adicionar 59,3 ml de hidróxido de sodio 1N y diluir a 2000 ml con agua. Verificar el pH con un potenciometro y ajustar a 7 si es necesario.
Preparación de la muestra
Disolver 100 g de la muestra en 10 ml de solución buffer pH 7. Prepare una tira de papel Whatman cromatografía tipo 3 mm, de coeficiente de corrimiento medio u otro equivalente en papel para electrofóresis y saturar el papel con solución buffer de pH 7. Usando una micropipeta aplicar 0,01 ml de la solución muestra a lo largo de la línea angosta del lado del cátodo del papel con un cambio en el papel de electrofóresis.
Aplique un potencial de aproximadamente 250 volts, deje que la electrofóresis continúe por 6 horas y remueva el papel de la cámara.
Detectar alguna riboflavina libre o difosfato de riboflavina, observando la línea a la luz del día o bajo luz ultravioleta. Si existe riboflavina libre, aparecerá como una banda cercana a la línea de inicio, y el difosfato de riboflavina aparecerá como la línea más alejada de la línea de inicio.
Precaución. La riboflavina se destruye si es expuesta a la luz ultravioleta por más de unos segundos.
Corte las bandas respectivas, colocándolas en matraces Erlenmeyer de 250 ml separados, conteniendo 35,0 ml de una mezcla de dioxano - agua (1:3), y permitiendo que se estabilice hasta que se eluyan completamente las manchas de las franjas.
13.3.2 Procedimiento
13.3.2.1 Usando un fluorómetro disponible, determine la intensidad de la fluorescencia de cada solución muestra y del estándar a una longitud de 530 nm, utilizando una longitud de onda de excitación de 460 nm.
13.3.2.2 La fluorescencia de las soluciones conteniendo la riboflavina y el difosfato de riboflavina, no serán mayores que las producidas por la preparación estándar.
13.4 Determinación de lumiflavina
13.4.1 Reactivo
Para preparar el estándar, diluya 3 ml de Dicromato de potasio 0,1N con agua, hasta 1000 ml.
Pase algo de cloroformo a través de una columna de alúmina para remover cualquier resto de etanol. Para 10 ml de este cloroformo, agregue 35 mg de la muestra, agite 5 minutos y filtre. El color del filtrado no deberá ser más intenso que el de 10 ml de la preparación estándar cuando es visto en recipientes idénticos.
13.4.2 Procedimiento
13.4.2.1 Realice la prueba bajo luz tenue. En un matraz volumétrico de vidrio color ambar de 500 ml, disuelva 10-0 mg de muestra en 100 ml de agua y agregue 2,5 ml de ácido acético glacial y aforarlo a 500 ml con agua. Coloque 20,0 ml de esta solución en un matraz volumétrico de vidrio color ámbar, agregue 3,5 ml de una solución 1,4% m/v de acetato de sodio y lleve a 200,0 ml con agua.
13.4.2.2 Mida la absorbancia (A) a un máximo de 444 nm.
% Total de materias colorantesA.5000 * 1,367
328.W
Donde: A= Absorbancia de la muestra a 444 nm.
W= Masa de la muestra en gramos.
13.5 Determinación de anilina
13.5.1 Procedimiento
13.5.1.1 Disolver 20 g de la muestra en 400 ml de agua y añadir 5 ml de hidróxido de sodio N. Agitar en un embudo de separación y separar con 4 porciones sucesivas de 50 ml de cloroformo, cada vez durante5 minutos. Con porciones sucesivas de 400 ml de hidróxido de sodio 0,1 N, lavar los extractos clorobencénicos reunidos hasta que la capa acuosa superior sea incolora. Filtrar la solución clorobencénica .
13.5.1.2 Tomar 75 ml de extracto clorobencénico agitar con 2 porciones sucesivas de 50 ml de ácido clorhídrico 0,5N, y luego con 2 porciones sucesivas de 25 ml de agua. Neutralizar los extractos acuosos reunidos con una solución de hidróxido de sodio al 30%; luego acidificar con 10 ml de ácido clorhídrico 0,5N.
13.5.1.3 Disolver en esta solución de 1-2 g de bromuro de potasio. Después de enfriar en agua helada añadir alrededor de 20 gotas de nitrato de sodio 0,1N y dejar reposar durante 10 minutos.
13.5.1.4 Eliminar el exceso de nitrato añadiendo ácido aminosulfónico. Verter la solución en unos 5 ml de una solución al 3% de sal R(sal sódica del ácido naftol-2-sulfónico-3,6) adicionado con 10 ml de hidróxido de sodio 2N. Dejar reposar durante 15 minutos. Acidificar la solución de colorante en presencia de rojo congo( indicador), hasta que éste vire al azul y filtrar. El colorante aminobencénico no pasará.
13.5.1.5 Añadir agua al filtrado hasta 200 ml; luego medir la extinción a 490 nm (E4).
13.5.2 Cálculo
Contenido en anilina =E4 * 266
(mg/kg)2,26 * d4
E 1 mg/ml490para anilina = 226
1 cm
14 GUANINA
14.1 Determinación de guanina e hipoxantina
14.1.1 Aparatos
Espectrofotómetro ultravioleta cubriendo un rango de espectro de 300 nm a 230 nm con escala de longitud de onda capaz de leer a 1 nm y absorbancia con una exactitud de 1% de error absoluto.
Matraces volumétricos de 1000, 500 y 100 ml.
Filtros de fibra de vidrio Reeve Angel No. 934 AH
Matraz Erlenmeyer de 250 ml
Crisol Gooch. Coors No. 4
Placa para calentar con agitador magnético
Barra magnética para agitar
Filtro de vidrio medio poroso
Vaso de precipitados de 200 ml de forma larga
Matraz de succión
Vidrio de reloj
Filtro Fisher
Agitador de vidrio
Pipetas de 5 y 50 ml
Celdas de absorción de cuarzo de 1 cm
14.1.2 Reactivos.
Solución buffer de carbonato-bicarbonato.
Disolver 13,44 g de bicarbonato de sodio (grado reactivo) y 45,75 g de carbonato de sodio anhidro en agua destilada y diluir a un litro.
Ayuda filtro (Johns-Manville), previamente lavado con agua-acetona 1:1 y secado.
Acetona grado ACS.
Solución de hidróxido de sodio 1N
Cristales anhidros de guanina
Cristales anhidros de hipoxantina.
Preparación del blanco.
Diluir 5 ml de hidróxido de sodio 1 N a 100 ml con agua. Transferir una alícuota de 10 ml a un matraz volumétrico de 1000 ml, añadir 50 ml de solución buffer de carbonato-bicarbonato y diluir a volumen con agua.
Preparación del estándar.
Pesar exactamente 150 mg de guanina cristalizada anhidra (secada a 105°C) y 136 mg de hipoxantina (secada a 105°C) en dos matraces volumétricos separados de 100 ml. Añadir 5 ml de hidróxido de sodio 1 N y calentar en baño de vapor para facilitar la disolución. Enfriar y diluir a volumen con agua.
Transferir una alícuota de 10 ml a un matraz volumétrico de 1000 ml añadir 50 ml de solución buffer de carbonato-bicarbonato y diluir a volumen con agua.
Medir la absorbancia de cada solución final a 273 nm y 259 nm en celdas de 1 cm como blanco.
Calcular E 1%1cm valuando ambas longitudes de onda para ambos estándares. Hacer varias determinaciones y sacar el valor promedio para usar en los cálculos. Una vez que el coeficiente de extinción del estándar ha sido determinado, éste necesita ser verificado periodicamente.
Preparación de la muestra.
Pesar exactamente una cantidad apropiada de muestra (1 g para un 10% de mezcla) del colorante (mezclada perfectamente) dentro de un vaso de precipitados de 200 ml de forma larga. Añadir acetona para dispersar la muestra y filtrar aproximadamente 4 g.
Mezclar bien. Filtrar a través de un crisol Gooch Coors No. 4 conteniendo filtro de fibra de vidrio. Lavar el vaso de precipitados y filtrar perfectamente con acetona mientras se va filtrando, permitiendo pasar completamente antes de lavar de nuevo. Repetir 4 veces el lavado con acetona. Entonces lavar el vaso de precipitados con agua para remover algún residuo de acetona.
14.1.3 Procedimiento
14.1.3.1 Transferir cuantitativamente el filtrado al fondo de un vaso de precipitados de forma larga de200 ml, poner una barra de agitación magnética. Lavar el crisol perfectamente con agua, adicionando el agua de lavado al vaso de precipitados.
14.1.3.2 Adicionar de 80 a 90 ml de agua y remover el material filtrado con agitación.
14.1.3.3 Añadir 5 ml de hidróxido de sodio 1 N , cubrir con un vidrio de reloj, calentar a ebullición agitando magnéticamente por 90 minutos. Con la ayuda del agua y un filtrador Fisher, filtrar la muestra caliente a través de un filtro de vidrio poroso conteniendo un filtro de ayuda, dentro de un matraz Erlenmeyer de 250 ml. Lavar el vaso de precipitados y el filtro de vidrio perfectamente con agua hasta que el volumen del filtrado esté claro, aproximadamente de 100 a 150 ml.
14.1.3.4 Transferir el filtrado cuantitativamente con ayuda de agua a un matraz volumétrico de 500 ml, enfriar y diluir a volumen con agua.
14.1.3.5 Medir la absorbancia de la solución a 273 nm en una celda de 1 cm contra el blanco.
14.1.3.6 Cálculos:
Coeficiente de extinción del estándar
E 1%1cm=A
C . I
donde:
A= Absorbancia a longiud de onda específica
C= Concentración % (p/v)
I= Longitud de onda en cm
Concentración de guanina e hipoxantina en la solución problema:
Cg = ( A273* Ah259 ) - (A259*Eh273)
( Eg273*Eh259 ) - (Eg259*Eh273)
Ch = ( A259*Eg273 ) - (A273*Eg259)
(Eg273*Eh259 ) - (Eg259*Eh273)
donde:
Cg= Concentración de guanina en % (p/v)
Ch= Concentración de hipoxantina en % (p/v)
A= Absorbancia a longitud de onda especificada
Eg= Coeficiente de extinción del estándar de guanina a longitud de onda especificada.
Eh= Coeficiente de extinción del estándar de hipoxantina a longitud de onda especificada.
Guanina e hipoxantina en la muestra:
% Guanina (p/p)= Cg * DF
wc
% Hipoxantina(p/p)= Ch * DF
w
donde:
Cg = Concentración de guanina en la solución problema
Ch = Concentración de hipoxantina en la solución problema
DF = Factor de dilución en ml
w = Peso de la muestra en gramos
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